二、凝胶电泳

1.选择合适胶浓度。分子量小的蛋白，建议配置5%的浓缩胶，分离胶浓度参考下表。

1.膜的选择。免疫印迹中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 膜等。推荐选用 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯），因为蛋白质与 PVDF 膜以疏水力结合，从而将亲水部位暴露到液相，使抗体更容易与之结合。

针对不同分子量的蛋白质，PVDF 膜有两种规格：0.45 μm 的膜适合检测 MW ＞ 20 kDa 的蛋白质，0.2 μm 的膜适合检测MW ＜ 20 kDa 的蛋白质，而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白质在转移过程中直接穿透过膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再转入转移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。

 

2.转膜方式。对于小分子蛋白，电流太大或时间太长容易转过。转膜采用湿转，条件参考下图。

分子量（kDa)	转膜条件
X≤10	恒流200mA,30min
10 < X≤15	恒流200mA,40min
15< X≤20	恒流200mA,50min

3.转膜前的平衡时间短点，几分钟甚至1min就好。平衡所用的液体及转膜液成份相同，都不要加SDS，效果是天壤之别。